３．２ 革兰氏染色镜检 取增菌产毒培养液涂片，作革兰氏染色镜检。典型的破伤风杆菌应为革兰氏阳性鼓槌样芽孢杆菌，菌体细长，成熟芽孢为正圆形，孢径大于菌体宽度，位于菌体一端，形似鼓槌状；未成熟芽孢为卵圆形，形似火柴或网球拍状，亦可见到游离散在的圆形芽孢。本菌培养时间较久，常为革兰氏染色阴性。
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｜供试品｜
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７５～８０℃ ｜２０分钟
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｜０．１％葡萄糖疱肉培养基｜
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３６±１℃ ｜ 厌氧培养７２－９６小时
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｜ ｜
产气、臭气、消化碎肉，镜检阳性 无产气、臭气、消化碎肉，镜检阴性
↓ ↓
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｜毒力试验｜ ｜报告｜
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｜
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｜ ｜
阳性 阴性
｜ ｜
｜ －－－－－－－－－－－－－－－－－－
｜ ｜ ｜
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｜报告｜ ｜０．１％葡萄糖疱肉培养基｜－－－ ｜分离培养｜
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３６±１℃｜厌氧培养７２－９６小时 ｜３６±１℃｜厌氧培养７２－９６小时
－－－－－－ ｜ ↓
｜毒力试验｜ ｜－－－－－－－－－－－－－－
－－－－－－ ｜｜０．１％葡萄糖疱内培养基｜
｜ ｜－－－－－－－－－－－－－－
－－－－－－－－－－－ ｜３６±１℃↓厌氧培养７２－９６小时
阳性 阴性 ｜ －－－－－－
↓ ↓ ｜ ｜毒力试验｜
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｜报告｜ ｜０．１％葡萄糖疱肉培养基｜－｜ ｜
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３６±１℃↓厌氧培养７２－９６小时 ｜ ｜
－－－－－－ 阳性 阴性
｜毒力试验｜ ↓ ↓
－－－－－－ －－－－ －－－－
｜ ｜报告｜ ｜报告｜
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｜ ｜
阳性 阴性
↓ ↓
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｜报告｜ ｜报告｜
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３．３ 毒力试验 选用１６～１８ｇ或１８～２２ｇ同性无孕健康小白鼠１８～３０只，分成３群（供试品２群，阳性对照１群）每群分成２组，每组３～５只，分别作产毒试验及破伤风抗毒素保护试验。
试验组：于小白鼠后腿内侧肌肉或背侧颈部皮下注射增菌产毒培养液０．３～０．５ｍｌ，注射６小时后，即可开始观察发病情况至４８小时。由破伤风外毒素引起的症状为小鼠强直性痉挛，抽搐。呈现弓背反张，腿部强直，尾巴竖立等症状，最后死亡。
抗毒素保护试验组：为证实小白鼠的上述症状是否由破伤风毒素所致，应与试验组同时进行破伤风抗毒素保护试验。先以注射用水稀释破伤风抗毒素使成１２０ｕ．／ｍｌ，再以１ｍｌ注射器吸取０．３～０．５ｍｌ与增菌产毒培养液等量混合后注射小白鼠；或先注射抗毒素，再于半小时内注射增菌产毒培养液６小时后与试验组同时观察结果（作小鼠毒力试验的适宜温度应为１５～３０℃）。若试验组小鼠呈现上述症状，保护试验组小鼠无上述症状而存活（破伤风毒素被抗毒素中和），即为毒力试验阳性。试验组和保护试验组小鼠均未呈现上述症状时，则为毒力试验阴性。
若第一次毒力试验为阴性，镜检发现疑似破伤风杆菌者，应再连续进行二次转种０．１％葡萄糖疱内培养基，每次均于３６±１℃厌氧培养７２～９６小时，再分别进行毒力试验（或仅在第二次转种培养后，做毒力试验），任一次毒力试验出现阳性结果，均可作出检出破伤风杆菌报告。
３．４ 分离培养 如镜检到疑似菌，而毒力试验阴性者，可将增菌产毒培养液划线接种于新霉素葡萄糖血琼脂（或血琼脂）平板，置３６±１℃厌氧培养３～４天。破伤风杆菌在上述平板上的血型菌落呈不规则形状，中心紧密、略突起，周边扩散成疏松的细丝状或蔓延生长呈雾状，灰白色、半透明，常有β溶血环。
若出现上述疑似菌落，应转种０．１％葡萄糖疱内培养基中，置３６±１℃厌氧培养７２～９６小时，再作毒力试验。
４．结果报告 镜检有疑似破伤风杆菌，毒力试验阳性，报告检出破伤风杆菌。镜检不论发现或未发现疑似破伤风杆菌，但毒力试验为阴性者，则均报告“未检出”破伤风杆菌。
注意：
（１）凡进行破伤风杆菌检验人员，应事先注射破伤风类毒素预防。
（２）操作时勿损伤皮肤。若有损伤，应立即注射破伤风抗毒素，以防感染。
活螨检验法
螨，属于节肢动物门，蛛形纲，蜱螨目，种类繁多，分布甚广。其生活习性各异，营自由生活或寄生生活。在土壤、池沼、江河和湖海里，动、植物体上，贮藏食品和药品中，都可能有它们的存在。
药品可因其原料、生产过程或包装、运输、贮存、销售等条件不良，受到螨的污染。
螨可蛀蚀损坏药品，使药品变质失效，并可直接危害人体健康或传播疾病。例如中成药中发现的腐食酪螨等，对人具有致病力。能引起皮炎及消化系统、泌尿系统、呼吸系统的疾病。因此，用于口服药品及创伤、粘膜和腔道等外用含中药的制剂规定不得检出活螨。
１．设备和材料
１．１ 显微镜，双筒实体显微镜
１．２ 放大镜
１．３ 解剖针、发丝针、小毛笔。
１．４ 载玻片及盖玻片
１．５ 酒精灯
１．６ 培养皿或小搪瓷盘（内衬黑色）
１．７ ３０％甘油水（简称甘油水）
２．活螨的一般检验法
２．１ 螨的形态特征
螨的体形微小，多在１ｍｍ以下。一般呈卵圆形或椭圆形，无头、胸、腹界限。幼螨足３对，若螨足四对，成螨足多数为四对。足通常由６节组成。口器向前端突出，螯肢常呈螯钳状，有齿，由２～３节组成。须肢节数因种类而异，由１～２节到５节组成，一般呈爪或钳状，偶尔为长形。有些种类在躯体前端或两侧有１～２对眼。躯体两侧对称，表面被有坚硬的几丁质的板，保护其内部器官和支持肌肉固定。体表有刚毛，它的形状、数目及彼此间长短比例和排列位置因种类而异。
螨类与蜘蛛、昆虫（如书虱），外形比较近似，因此，必须注意它们之间的主要区别，见表１０
表１０： 螨与蜘蛛、昆虫主要形态鉴别
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｜ 特征 ｜成螨（如腐食酪螨）｜ 蜘 蛛 ｜ 昆虫（如书虱） ｜
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｜ 分类 ｜ 蛛形纲，蜱螨目 ｜ 蜘形纲，蜘蛛目｜ 昆虫纲，啮虫目 ｜
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｜ 足 ｜ ４对 ｜ ４对 ｜ ３对 ｜
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｜ 触角 ｜ 无 ｜ 无 ｜ １对 ｜
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｜ 体段 ｜头、胸、腹无界限 ｜分头胸部和腹部 ｜ 分头、胸、腹三部分｜
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２．２ 检验方法
２．２．１ 直检法：取供试品先用肉眼观察，有无疑似活螨的白点或其它颜色的点状物，再用５～１０倍放大镜或双筒实体显微镜检视，有螨者，用解剖针或发丝针或小毛笔挑取活螨放在滴有一滴甘油水的载玻片上，置显微镜下观察。
２．２．２ 漂浮法：将供试品放在盛有饱和食盐水的扁形称量瓶或适宜的容器内，加饱和食盐水至容器的２／３处，搅拌均匀，置１０倍放大镜或双筒实体显微镜下检查，或继续加饱和食盐水至瓶口处（为防止盐水和样品溢出污染桌面，宜将上述容器放在装有适量甘油水的培养皿中），用洁净的载玻片盖在瓶口上，使玻片与液面接触，沾取液面上的漂浮物，置显微镜下检查。
２．２．３ 分离法：也称烤螨法。将供试品放在特制的分离器或附有孔径大小适宜的筛网的普通玻璃漏斗里，利用活螨避光、怕热的习性，在漏斗的广口上面放１个６０～１００ｗ的灯泡，距离药品约６ｃｍ处，照射１～２小时。活螨可沿着漏斗内的底部细颈内壁向下爬，用小烧杯装半杯甘油水，放在漏斗的下口处，收集爬出来的活螨。
３．各剂型药品的活螨检验方法
供试品取样量：各剂型供试品，每批应抽取两瓶或两盒以上的包装单位；贵重或微量包装的供试品，取样量可酌减。必要时，可再次抽样，或选取有疑问的样品进行检验。
３．１ 大蜜丸：将药丸外壳（蜡壳或纸蜡壳等）置酒精灯小火焰上转动，适当烧灼（杀灭外壳可能污染的活螨）后，小心打开。
３．１．１ 表面完好的药丸，可用消毒的解剖针刺入药丸，手持解剖针，在放大镜或双筒实体显微镜下检查。同时注意检查丸壳的内壁或包丸的油纸有无活螨。
３．１．２ 有虫粉现象的药丸，可用放大镜或双筒实体显微镜直接检查，也可用漂浮法检查。
３．２ 小蜜丸、水丸和片剂
３．２．１ 表现完好的丸、片，可将药品放在预先衬有洁净黑纸的培养皿或小搪瓷盘中，用直检法检查。如未检出螨时，认为有必要，也可再用漂浮法或烤螨法检查。
３．２．２ 有虫粉现象的丸、片，可用直检法或漂浮法检查。同时注意检查药瓶内壁与内盖有无活螨。
３．３ 散剂、冲剂和胶囊剂等
先直接检查药瓶内盖及塑料薄膜袋的内侧有无活螨。后将药品放在衬有洁净黑纸的搪瓷盘里，使成薄层，直接检查。必要时，可再用漂浮法检查。并注意检查药瓶内壁是否有螨。
３．４ 块状冲剂
直接检查供试品的包装蜡纸、玻璃纸或塑料薄膜及药块表面有无活螨。有虫粉现象者，除用直检法检查外，再用漂浮法检查。
３．５ 液体制剂及半固体膏剂
先用７５％酒精将药瓶的外盖螺口周围消毒后小心旋开外盖，用直检法，检查药瓶外盖的内侧及瓶口内外的周围与内盖有无活螨。
３．６ 除上述以外的其它剂型
可视具体情况参照上述有关方法检查。
４．活螨卵（如腐食酪螨卵）的检验方法
螨卵极小，一般在０．１ｍｍ以下，呈乳白色，椭圆形或卵圆形。须用１０～２０倍放大镜或显微镜方可查见。螨卵常见于活螨群的周围，但在未检出活螨的样品中，亦有检出螨卵者。一般在供试品中已经检出活螨的，不再进行螨卵的检查。对可疑供试品，未检出活螨时，可注意检查活螨卵。
检验方法：可采用检验活螨项下的直检法或漂浮法检查。凡用上述两种方法检查，如发现可疑螨卵时，用发丝针小心挑取。取一块凹形载玻片，在凹窝中央滴入２滴甘油水，将挑取物放入甘油水中，置显微镜下检查。为确证挑取物是否为活螨卵，可将上述载玻片置培养皿中，加盖，于２２～３０℃培养３～８天，每天上、下午定时用低倍显微镜观察，如在甘油水液中孵出幼螨，则判断为检出活螨卵。
５．供试品检验报告
凡供试品按上述有关剂型项下规定检验，发现活螨者，应作检出活螨报告。
在供试品中未检出活螨，但检出活螨卵时，可按检出活螨处理。
为保留阳性结果备查，可将检出的螨按下法处理保存：将活螨挑放在载玻片上预先滴有１滴７５％乳酸溶液中，加上载玻片。手持载玻片，在酒精灯小火焰上来回移动，缓缓加热片刻，使其适当透化，即可镜检。鉴定后的螨体，可取下放入７０％酒精中保存，或适当处理。
发丝针的制作：取长约１．５ｃｍ的头发丝一根和长约１０ｃｍ的小金属棒１根，以头发丝长度的一半紧贴在金属棒的一端，用细棉线将其缠紧，然后粘上加拿大树胶或油漆，晾干，即得。
无菌检查法（中国药典１９９０年版）
无菌检查法系指检查药品与敷料是否无菌的一种方法。
无菌检查的全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物的污染。
生物制品应按《生物制品制造及检定规程》中有关无菌检查的规定办理。
培养基及其制备方法
１．需气菌、厌气菌培养基（液体硫乙醇酸盐）
酪胨（胰酶水解） １５ｇ
葡萄糖 ５ｇ
Ｌ－胱氨酸 ０．５ｇ
硫乙醇酸钠 ０．５ｇ
（或硫乙醇酸 ０．３ｍｌ）
酵母浸出粉 ５ｇ
氯化钠 ２．５ｇ
新鲜配制的０．１％刃天青溶液 １．０ｍｌ
（或新鲜配制的０．２％亚甲蓝溶液 ０．５ｍｌ）
琼脂 ０．５～０．７ｇ
蒸馏水 １０００ｍｌ
除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成份加入水内，微温溶解后，调节ＰＨ为弱碱性，煮沸、滤清，按量加入葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调节ＰＨ值使灭菌后为７．１±０．２，分装，１１５℃灭菌３０分钟
２．霉菌培养基
蛋白胨 ５ｇ
葡萄糖 １０ｇ
磷酸二氢钾（ＫＨ2ＰＯ4） １ｇ
硫酸镁（ＭｇＳＯ4·７Ｈ2Ｏ） ０．５ｇ
蒸馏水 １０００ｍｌ
除葡萄糖外，取上述成份加入水内，微温溶解后，调节ＰＨ约６．０，煮沸，加葡萄糖溶解后，摇匀，滤清，调节ＰＨ值使灭菌后为５．８±０．２，分装，１１５℃灭菌３０分钟。
