四、实验室检测
（一）包涵体的检测。
1. 血片及白细胞涂片制备
采集的抗凝血标本尽快用血球层推血片，待干燥后冷丙酮固定10min；或提取抗凝血中的白细胞并进行涂片，待干燥后冷丙酮固定10min。
2. 染色
通常采用瑞氏（Wright）染色法、姬氏（Giemsa）染色法及瑞－姬混合染色法。有条件的实验室，可使用美国CDC推荐的染色方法。
3. 染液配置方法
（1）瑞－姬染液：取瑞氏染料和姬氏染料各0.5 g，以甲醇研溶，加甲醇500ml保存，每天摇匀1次，1周后可使用。
（2）改良Mc Donald法瑞－姬染色剂：75 ml甘油（分析纯）中加入磷酸盐缓冲液（Na2HPO4 1g和KH2PO4 2g），以4 ml蒸馏水溶解，37 ℃水浴24 h溶解混匀，用滤纸过滤，保存于密封的棕色瓶中备用。上述甘油缓冲液1.5 ml加瑞－姬染色剂50 ml，混匀后备用。
4. 染色步骤
血推片或白细胞涂片分别以两种染色剂染色2 min，再加蒸馏水作用5 min，用自来水冲洗。
5. 结果观察
中性粒细胞中可见桑葚状包涵体（见图1），并注意保存相关标本，以便进行复核。
（二）血清学检测。
常用血清学方法为间接免疫荧光（IFA）法。采集急性期（发热初期，一般发病1周内）与恢复期（至少间隔2-3周）双份血清。如恢复期血清抗体检测阴性，应建议医生采集第3份血液样本（间隔2-4周）。
1. 试剂
使用国际推荐的、经过ISO质量认证的产品。
2. 方法及操作按说明书进行。
3. 结果解释
IFA检测结果解释按说明书进行。
如果同时检测双份血清，IgG抗体4倍升高，则结果强烈支持嗜吞噬细胞无形体感染。如果急性期抗体升高，而恢复期没有升高或轻微升高，则应采集第3份血液样本（间隔2-4周）进行进一步检测。
（三）嗜粒细胞无形体核酸PCR检测。
目前，国际推荐使用16S rRNA基因检测方法，有条件的实验室，可进一步选用热休克蛋白基因groEL扩增方法。
1. DNA提取
用急性期、未使用抗生素的EDTA抗凝血或非抗凝血血球部分、白细胞及蜱研磨液提取DNA。最后，以AE缓冲液50µl抽滤以提高回收的DNA浓度。如采用血液白细胞层提取DNA，可明显提高阳性检出率。实验时，应采集当地正常人血液同时提取DNA，作为PCR的阴性对照。
2. PCR扩增
（1）16S rRNA基因检测：16S rRNA 高度保守，是PCR检测最常用的扩增靶基因，巢式PCR检测可提高检测灵敏度和特异度，采用属特异及种特异引物同时进行检测。PCR检测应分区进行，避免污染。使用引物序列见表1。
表1 巢式PCR检测无形体及埃立克体16S rRNA基因常用引物
引物名称
| 序 列
| 片段长度（bp）
|
Eh-out1（AF414399）
| 5’-TTG AGA GTT TGA TCC TGG CTC AGA ACG-3’
| 653
|
Eh-out2（AF414399）
| 5’-CAC CTC TAC ACT AGG AAT TCC GCT ATC-3’
|
Eh-gs1（AF414399）
| 5’-GTA ATA CT GTA TAA TCC CTG-3’
| 282
|
Eh-gs2（AF414399）
| 5’-GTA CCG TCA TTA TCT TCC CTA-3’
|
HGA1
| 5’-GTC GAA CGG ATT ATT CTT TAT AGC TTG -3’
| 389
|
HGA2
| 5’-TAT AGG TAC CGT CAT TAT CTT CCC TAC-3’
|
PCR反应混合物的准备按常规进行。第一轮反应采用外引物对Eh-out1和Eh-out2，DNA模板10µl（白细胞提取的DNA可适当减少）。PCR反应体系总体积为25µl或50µl（需要进行PCR测序或克隆时，应适当扩大反应体系），其它成分的浓度按常规进行。反应程序如下：
94℃ 5min
40循环：94℃ 45sec
55℃ 50sec
72℃ 1min
72℃ 总延伸 5min
第二轮反应使用2对引物分别进行巢式PCR。2对引物分别是无形体属及埃立克体属通用内引物（Eh-gs1、Eh-gs2）；以及HGA种特异性引物（HGA1及HGA2）。检测样本取第一轮产物1-2µl为模板，阳性对照取0.5µl为模板。反应程序同第一轮反应。
（2）热休克蛋白基因groEL扩增
与groEL基因的应用相比，16S rRNA基因的应用更为广泛，但groEL基因在不同种属间具有较大的变异性。因此，对于诊断及菌株的鉴定，groEL基因均具有重要意义。该基因扩增使用巢式PCR，引物序列见表2。
表2 groEL基因扩增常用引物
引物名称
| 序 列
| 退火温度
| 片段长度bp）
|
HS1
| 5’-TGG GCT GGT A（A/C）TGA AAT
| 52℃
| 1431
|
HS6
| 5’-CCI CCI GGI ACI A（C/T）ACC TTC
|
HS43
| 5’-AT（A/T）GC（A/T） AA（G/A）GAA GCA TAG TC
| 55℃
| HGA480
|
HS45
| 5’-ACT TCA CG（C/T）（C/T）TCA TAG AC
| HME528
|
DNA提取同上。PCR检测时，反应混合物的准备按常规进行。DNA模板量同16S rRNA基因检测。巢式PCR第一轮反应采用外引物对HS1及HS6。
反应程序如下：
3循环：94℃ 1min
48℃ 2min
70℃ 90sec
37循环：88℃ 1min
52℃ 2min
70℃ 90sec
68℃ 总延伸 5min
第二轮PCR引物采用HS43及HS45。检测样本取第一轮产物1-2µl为模板，阳性对照取0.5µl为模板。反应程序同第一轮反应。反应程序同第一轮反应，但退火温度由52℃改为55℃。
3．测序及分析
对扩增产物进行测序并进行同源比较，分析当地流行株与其它地区的变异性。
（四）病原体分离培养。
多用HL-60进行嗜吞噬细胞无形体的分离培养。最常用的分离方法是将白细胞部分接种培养基，然后将100-500µl抗凝血接种到悬浮有2×105或1×106细胞内， 每2-3天染色检查包涵体，一般5-10天可查见包涵体。由于分离可能受到红细胞的影响，因此，建议使用以下方法：
1.白细胞分离：采用密度梯度离心方法（Ficoll-Paque）。一般采用2-3 ml EDTA抗凝血，用2倍体积的无菌Hanks 平衡盐溶液稀释，最后采用Histopaque（Sigma，St . louis， Mo）密度梯度离心分离白细胞，可以获得较高的白细胞，用以分离HGA。采用白细胞分离方法进行接种时，应注意防止操作过程中的污染。
2. 红细胞裂解后收集白细胞（NHCl4裂解法）。
3. 在使用含有红细胞的标本培养后，另加入宿主未感染的细胞，建立混合培养。
血液白细胞悬浮于2ml体积、含有5-10%胎牛血清的培养基中，且在25 cm2培养瓶内与培养细胞作用3小时。37℃、5% CO2 条件下振摇孵育，可增加病原体与细胞的作用。
病原体的鉴定：可通过种特异引物进行PCR鉴定。
五、生物安全
在标本采集、运输及实验室工作过程中，生物安全应参照《
病原微生物实验室生物安全管理条例》中的有关要求进行。
（一）实验室生物安全。
标本灭活、病原DNA标本提取及病原体分离操作应在生物安全Ⅱ级实验室进行。非感染性材料的检测可在生物安全I级实验室进行。
（二）血液标本采集安全注意事项。
采集病例的标本时，应做好个人防护。采集者应戴乳胶手套，尽量避免病例的血液外溢或直接接触。如发生血液外溢污染环境时，应及时采用75%酒精或常用消毒剂进行消毒处理。应按照对传染性样本的要求，对采集标本的器具及病人止血棉球及时进行消毒处理。防止锐器扎伤皮肤，一旦发生，应按临床外科要求，及时进行伤口清创。如直接沾染了临床诊断病例或确诊病例的血液，除及时消毒皮肤外，应口服强力霉素预防感染，服用剂量参照《人粒细胞无形体病诊疗方案（试行）》（附件1）。
